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Aug 06, 2023

Amélioration de la tolérance à la sécheresse des mutants mutagénisés EMS de la luzerne (Medicago sativa L.) par criblage in vitro au stade de la germination

Rapports scientifiques volume 12,

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 12693 (2022) Citer cet article

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Les objectifs de cette étude étaient de déterminer le nouveau mutant tolérant à la sécheresse des génotypes de luzerne (Medicago sativa L.) en criblant les graines 340675 M3 mutagénisées par EMS aux stades de germination en présence d'un stress osmotique de 35 % de PEG6000. Le test de croissance des racines a fourni plusieurs mutants candidats tolérants à la sécheresse. Parmi ceux-ci, 4 mutants ont été évalués plus avant dans des conditions de déficit hydrique appliquées pendant 24 jours après la première coupe au stade bouton floral. Les résultats ont révélé que les mutants déterminés comme tolérants à la sécheresse au stade de la germination étaient également tolérants aux conditions de déficit hydrique. La teneur en protéines et les valeurs de superoxyde dismutase se sont avérées plus élevées chez tous les mutants que chez les témoins. Les valeurs des peroxydes d'ascorbate, de la glutton réductase et de la lipide peroxydase variaient en fonction du génotype mutant et de la durée du stress hydrique. Le stress hydrique a considérablement modifié les niveaux de transcription des gènes MtP5CS, MtDehyd, MseIF-2, MtRD2 et MsNAC. Ces résultats ont indiqué que le criblage in vitro de graines mutantes de luzerne pour la tolérance osmatique à la germination et aux premiers stades de croissance des semis a permis de déterminer avec succès les mutants de luzerne tolérants à la sécheresse qui étaient également tolérants aux conditions de déficit hydrique après la première coupe au stade du bouton de floraison.

Le réchauffement climatique menace aujourd'hui la production agricole en limitant l'eau d'irrigation nécessaire à la production végétale1. Par conséquent, le développement de nouvelles variétés végétales capables de mieux tolérer les conditions de stress hydrique et de minimiser les pertes de rendement revêt une importance stratégique pour assurer la sécurité alimentaire des générations futures. Cependant, la structure complexe du mécanisme de stress hydrique est l'une des principales raisons de la lenteur des progrès des études de sélection2. La tolérance à la sécheresse montre un héritage quantitatif contrôlé par plusieurs gènes3. Les relations épistatiques et pléiotropiques entre ces gènes rendent également leur mise en pratique extrêmement difficile pour les études de sélection3. En outre, des facteurs tels que les périodes de développement d'une plante, la durée et la sévérité des stress sont également des déterminants importants pour évaluer l'étendue de l'hérédité quantitative du stress hydrique4.

Les plantes tolérantes à la sécheresse ont la capacité de remplir leurs fonctions normales même dans des conditions de faible potentiel hydrique5. Les plantes utilisent plusieurs stratégies dans des conditions de déficit hydrique pour minimiser les effets délétères du stress hydrique aux niveaux physiologique, morphologique et transcriptionnel. Les plantes utilisent également une stratégie d'évasion qui est définie comme la capacité des plantes à maintenir un potentiel hydrique élevé dans des conditions de sécheresse. Cette stratégie est généralement fournie par certains changements agro-morphologiques des plantes, tels que la réduction de la surface foliaire, la réduction du nombre et de la conductivité des stomates, la formation de systèmes racinaires denses et l'augmentation du rapport racine/tige6.

La luzerne (Medicago sativa L.) est une culture fourragère essentielle et a une importance économique significative dans le monde entier en raison de sa contribution inestimable à l'agriculture et à l'élevage durables de diverses manières7, notamment un rendement élevé en foin, une qualité nutritionnelle exceptionnelle et une capacité de fixation de l'azote8. Les variétés cultivées au sein des espèces de luzerne sont autotétraploïdes avec des génomes presque identiques9. La luzerne est généralement montrée comme tolérante à la sécheresse en raison de son système racinaire profond qui est généralement prononcé dans les quelques années suivant la plantation10. Cependant, en plus de la germination et de la croissance précoce des semis, le stade de repousse de la luzerne juste après la coupe de l'année de plantation est très vulnérable au stress hydrique. De plus, la luzerne a besoin de beaucoup plus d'eau d'irrigation que les autres plantes cultivées, en particulier dans les zones arides, car elle est récoltée plusieurs fois et fournit le fourrage le plus productif au cours d'une saison de croissance.

Bien qu'un succès partiel ait été obtenu dans le développement de nouvelles variétés de luzerne qui tolèrent divers stress abiotiques, y compris la sécheresse11, des progrès très limités ont été réalisés par rapport à d'autres espèces de cultures importantes12. De plus, l'identification des plantes tolérantes au stress hydrique par sélection directe dépend principalement à la fois de la variation génétique du matériel utilisé et du succès des méthodes de criblage. Il semble très difficile de développer de nouveaux génotypes de luzerne tolérants à la sécheresse en utilisant la méthode de croisement et en criblant une base génétique étroite de luzerne13. Par conséquent, nous avons utilisé la mutagenèse du méthane sulfonate d'éthyle (EMS) pour créer une nouvelle variation génétique. Le criblage des graines mutantes M3 au stade de la germination dans des conditions in vitro a donné plusieurs candidats tolérants à la sécheresse. Quatre d'entre eux ont également été réévalués aux niveaux physiologique, morphologique et transcriptionnel dans des conditions de déficit hydrique appliquées pendant 24 jours après la première coupe au stade bouton floral qui a également été considéré comme une autre étape critique pour déterminer les performances de repousse de la luzerne dans des conditions de croissance irriguées et non irriguées. Les réponses au stress de sécheresse des mutants ont été comparées avec des plantes témoins irriguées et non irriguées.

Le criblage de 340675 graines M3 aux stades de germination et de croissance précoce des semis en présence d'un stress osmotique de 35% de PEG6000 a donné plusieurs candidats tolérants à la sécheresse (Fig. 1). Parmi ceux-ci, 4 mutants ont été testés plus avant pour les performances de repousse dans des conditions de déficit hydrique appliquées pendant 24 jours après la première coupe au stade du bouton de floraison et les résultats ont été comparés avec des plantes témoins irriguées (Z1) et non irriguées (Z2) (tableau 1).

Criblage de graines M3 mutantes et de plantules développées. (A) Vue rapprochée des graines plantées sur le brut du support MS contenant 35 % de PEG6000. (B) *, graines témoins non mutées; **, graines M3 mutantes. (C – D) Semis candidats mutants issus du criblage. Les flèches indiquent les allongements des radicules. (E – F) Semis sauvés des milieux MS et plantés dans des violes. (G – H) Semis plantés dans un pot en plastique et la plante s'est développée au stade du bouton de floraison.

Les résultats des paramètres agro-morphologiques ont révélé des variations importantes non seulement au sein des mutants M3, mais ils ont également montré des différences significatives par rapport aux plantes témoins (tableau 1). La hauteur de la plante des mutants au 18e jour de stress hydrique variait de 36,3 cm à 45,7 cm, tandis que les témoins Z1 et Z2 avaient respectivement une hauteur de plante de 42,1 cm et 38 cm (tableau 1). Lorsque le stress hydrique a été étendu à 24 jours, tous les mutants à l'exception d'un (mutant Y20) ont donné une hauteur de plante plus longue que le témoin Z2 (52,0 cm). La tige principale s'est généralement épaissie lorsque le stress hydrique s'est prolongé du 18e au 24e jour, à l'exception du mutant Y20 et du témoin Z2 (tableau 1). Les effets du stress hydrique sur la hauteur naturelle des plantes des mutants variaient en fonction de la durée de la sécheresse. Le nombre de branches latérales variait de 2 à 9 et de 4 à 11 par plante aux 18e et 24e jours de stress hydrique, respectivement. À l'exception du mutant Y20, la durée du stress hydrique a augmenté le nombre de branches latérales chez tous les mutants ainsi que chez les plantes témoins (tableau 1). Le nombre de feuilles par plante a augmenté sur les témoins et la plante mutante X6 tandis qu'une diminution du nombre de feuilles par plante a été déterminée sur les mutants Y20, Y25 et Y35 lorsque le stress hydrique a été prolongé de 18 à 24 jours (tableau 1). Le stress hydrique a réduit la longueur et la largeur des folioles moyennes chez tous les mutants et les témoins les jours 18 et 24 du stress hydrique (tableau 1). Cependant, le taux de réduction était moindre sur les mutants que sur la plante témoin Z2 (tableau 1). Les températures du couvert végétal se sont révélées significativement différentes entre les témoins et les mutants les jours du 18 et du 24 du stress hydrique (tableau 1). Les mutants Y20 et Y30 avaient une température de canopée inférieure à celle des deux témoins au 18e jour de stress hydrique, tandis que la température de canopée était significativement plus basse sur le mutant Y20 que les autres mutants le 24e jour de stress hydrique (tableau 1). Le plus grand nombre de graines par gousse (2 graines / gousse) et le rendement en graines le plus élevé par plante (1, 34 g / plante) ont été obtenus à partir du mutant X6 tandis que le mutant Y35 n'a donné aucune graine (tableau 1). La couleur des fleurs des mutants variait du rose au violet tandis que les témoins n'avaient que du rose (tableau 1).

Le stress hydrique a considérablement réduit la teneur en protéines de la luzerne (p < 0,001) (Fig. 2A). Cependant, la teneur globale en protéines des mutants Y20 et Y30 s'est avérée supérieure à celle des plantes témoins (Z1 et Z2), tandis que les mutants X6 et Y35 avaient le même niveau de teneur en protéines avec le contrôle irrigué (Z1) (Fig. 2B). Parmi les mutants, le mutant Y20 a donné la teneur globale en protéines la plus élevée (100, 68 mg / ml) tandis que le mutant Y35 avait la plus faible (66, 04 mg / ml) considéré tous les intervalles de temps (Fig. 2B). Les niveaux de protéines du mutant Y20 ont augmenté de manière significative au fur et à mesure du stress hydrique alors qu'il était stable chez le mutant Y30 à tous les intervalles de temps testés (Fig. 2C). Les niveaux de protéines les plus élevés (104, 9 mg / ml et 118, 60 mg / ml) ont été obtenus à partir du mutant Y20 tandis que le contrôle Z2 avait 25, 30 mg / ml et 35, 75 mg / ml aux 18e et 24e jours de stress hydrique, respectivement (Fig. 2C).

Teneur en protéines. (A) Effets globaux du stress hydrique sur les mutants et les plantes témoins à des intervalles de temps donnés, n = 18. (B) Teneur globale en protéines des plantes mutantes et témoins, n = 9. (C) Effets du stress hydrique sur la teneur en protéines des mutants et des plantes témoins à des intervalles de temps donnés, les barres d'erreur indiquent l'écart type, n = 3. Différentes lettres indiquent des différences significatives à P < 0,05. Les lettres majuscules, minuscules ou italiques minuscules indiquent une analyse statistique effectuée sur des intervalles de temps donnés.

Le stress hydrique a considérablement réduit les niveaux d'isoenzymes SOD (Fig. 3A) et le mutant Y35 avait le niveau de SOD le plus élevé (1, 54 U / mg de protéine) (Fig. 3B). Dix-huit jours de stress hydrique ont augmenté de manière significative les niveaux de SOD chez les témoins et les plantes mutantes X6, bien que les niveaux de SOD aient diminué de manière significative jusqu'à un niveau observé avant le stade de la coupe chez les autres mutants (Fig. 3C). Contrairement aux témoins et au mutant X6, les niveaux d'enzyme SOD ont augmenté de manière significative le 24 du stress hydrique sur les mutants (Fig. 3C).

Niveaux d'isoenzymes superoxyde dismutase (SOD). (A) Effets globaux du stress hydrique sur les mutants et les plantes témoins à des intervalles de temps donnés, n = 18. (B) Niveaux globaux de SOD des plantes mutantes et témoins, n = 9. (C) Effets du stress hydrique sur les niveaux de SOD des plantes mutantes et témoins à des intervalles de temps donnés, les barres d'erreur indiquent l'écart type, n = 3. Différentes lettres indiquent des différences significatives à P <0,05. Les lettres majuscules, minuscules ou italiques minuscules indiquent une analyse statistique effectuée sur des intervalles de temps donnés.

La première période de stress hydrique (18 jours) a diminué les niveaux de TBARS (Fig. 4A) alors qu'aucune différence significative n'a été détectée entre les périodes avant la coupe et le 24ème jour de stress hydrique (Fig. 4A). Les niveaux de TBARS les plus élevés (3, 80 et 3, 36 nmol / g de protéine) ont été obtenus à partir des mutants Y20 et X6, respectivement, tandis que le mutant Y35 avait le plus bas (1, 83 nmol / g de protéine) (Fig. 4B). Le mutant Y35 a augmenté le niveau de TBARS lorsque le stress hydrique s'est prolongé de 18 à 24 jours, tandis que le mutant Y30 l'a diminué (Fig. 4C). En général, un schéma similaire de niveaux de TBARS a été détecté sur les témoins et les mutants Y20 et X6 à des intervalles de temps donnés de stress hydrique par rapport aux niveaux de TBARS avant le stade de coupe (Fig. 4C).

Niveaux de substances réactives à l'acide thiobarbiturique (TBARS). (A) Effets globaux du stress hydrique sur les mutants et les plantes témoins à des intervalles de temps donnés, n = 18. (B) Niveaux globaux de TBARS des plantes mutantes et témoins, n = 9. (C) Effets du stress hydrique sur les niveaux de TBARS des plantes mutantes et témoins à des intervalles de temps donnés, les barres d'erreur indiquent l'écart type, n = 3. Différentes lettres indiquent des différences significatives à P <0,05. Les lettres majuscules, minuscules ou italiques minuscules indiquent une analyse statistique effectuée sur des intervalles de temps donnés.

L'activité enzymatique APX la plus élevée (0, 17 U / mg de protéine) a été déterminée le 18e jour de stress hydrique par rapport aux autres intervalles de temps testés (Fig. 5A). L'activité APX était la plus élevée (0, 19 U / mg de protéine) sur le contrôle Z2 alors qu'aucune différence significative n'a été détectée entre le mutant Y35 (0, 148 U / mg de protéine) et le contrôle Z1 (0, 130 U / mg de protéine) pris en compte. périodes de temps globales (Fig. 5B). Le mutant Y35 avait le niveau global d'APX le plus élevé par rapport aux autres mutants (Fig. 5B). L'activité APX était la plus élevée sur le mutant Y35 tandis que les deux témoins avaient l'activité APX la plus faible au moment de la coupe (Fig. 5C). L'activité enzymatique APX a augmenté de manière significative au 18e jour de stress hydrique sur les témoins et le mutant X6 par rapport aux niveaux déterminés avant la coupe, tandis que statistiquement, les mêmes niveaux d'activité enzymatique APX ont été déterminés sur le témoin irrigué (Z1) et les mutants au 18e jour de stress hydrique (Fig. 5C). À l'exception du mutant Y35, des niveaux réduits d'activité enzymatique APX ont été déterminés sur les plantes témoins et mutantes le 24e jour de stress hydrique par rapport au 18e jour de stress hydrique, bien que le mutant Y35 ait le même niveau d'activité enzymatique APX avec les deux contrôles (Fig. 5C).

Activité enzymatique de l'ascorbate peroxydase (APX). (A) Effets globaux du stress hydrique sur les mutants et les plantes témoins à des intervalles de temps donnés, n = 18. (B) Niveaux APX globaux des plantes mutantes et témoins, n = 9. (C) Effets du stress hydrique sur les niveaux APX des plantes mutantes et témoins à des intervalles de temps donnés, les barres d'erreur indiquent l'écart type, n = 3. Différentes lettres indiquent des différences significatives à P <0,05. Les lettres majuscules, minuscules ou italiques minuscules indiquent une analyse statistique effectuée sur des intervalles de temps donnés.

Les niveaux de GR ont considérablement augmenté pendant le stress hydrique par rapport à avant la coupe (Fig. 6A). Bien qu'une diminution significative ait été observée à la fin du stress hydrique, le niveau global de GR était significativement plus élevé qu'avant l'étape de coupe (Fig. 6A). Le niveau global de GR le plus élevé (0,098 (U/mg de protéine) a été obtenu à partir du contrôle Z2 alors qu'aucune différence significative n'a été déterminée sur les mutants et le contrôle Z1 (Fig. 6B). Des différences significatives ont été déterminées sur les niveaux de GR des contrôles et des plantes mutantes pour toutes les périodes de temps données (Fig. 6C). Le stress hydrique a augmenté de manière significative les niveaux de GR dans les plantes témoins et mutantes, à l'exception du mutant Y35, bien que la quantité de GR ait été relativement plus faible sur les mutants que sur les plantes témoins (Fig. 6C).À l'exception du mutant X6, les mutants ont montré un niveau accru de GR le 24e jour de stress hydrique, tandis qu'une teneur en GR réduite a été déterminée sur les témoins par rapport au 18e jour de stress hydrique (Fig. 6C). 6C).

Activité enzymatique de la glutathion réductase (GR). (A) Effets globaux du stress hydrique sur les mutants et les plantes témoins à des intervalles de temps donnés, n = 18. (B) Niveaux globaux de GR des plantes mutantes et témoins, n = 9. (C) Effets du stress hydrique sur les niveaux de GR des plantes mutantes et témoins à des intervalles de temps donnés, les barres d'erreur indiquent l'écart type, n = 3. Différentes lettres indiquent des différences significatives à P < 0,05. Les lettres majuscules, minuscules ou italiques minuscules indiquent une analyse statistique effectuée sur des intervalles de temps donnés.

L'expression du gène MtP5CS a montré une grande variation, avec des augmentations de 0,31 fois (X6) à 4,71 fois (Y30) le 18e jour de stress hydrique, bien que les niveaux d'expression aient diminué à 0,03 (mutant Y30) et 1,14 fois (X6) le 24e jour de stress hydrique (Fig. 7A). D'autre part, les niveaux d'expression du gène MtP5CS ont diminué sur le contrôle Z2 de 18, 6 fois à 0, 9 fois lorsque le stress hydrique a été prolongé de 18 à 24 jours, tandis que le contrôle Z1 a augmenté le niveau d'expression du même gène de 3, 49 fois à 21, 75 fois sur les mêmes intervalles de temps (Fig. 7A). À l'exception du mutant X6, des modèles d'expression similaires ont été observés sur les mutants en réponse au stress hydrique, tandis que le témoin Z1 présentait une expression élevée du gène MtP5CS alors que le stress hydrique s'étendait sur 18 à 24 jours (figure 7A).

Niveaux d'expression relatifs des gènes sensibles à la sécheresse à des intervalles de temps donnés (A–E) Modifications de l'expression de MtP5CS (Medicago truncatula pyrroline-5-carboxylate synthetase) (A), MtDehyd (Medicago truncatula dehydrin) (B), MseIF-2 (Medicago sativa eucaryotic translation initiation factor 2) (C), MtRD2 (Medicago truncatula Response to Desiccation 2) (D ) et MsNAC (Medicago sativa NAC; NAM, ATAF et CUC2) (E) dans les tissus foliaires de plantes mutantes de luzerne. L'ARNr Ms18s (ARN ribosomal 18S) a été utilisé comme gène de référence. Les résultats présentés sont des moyennes ± erreur standard, n = 3. Des lettres différentes indiquent des différences significatives à P < 0,05.

La régulation de MtDehyd, également connue sous le nom de gène LEA (late-embryogenese abondant), a montré de grands changements en réponse au stress hydrique appliqué après la première coupe au stade du bourgeon et les niveaux de régulation du gène apparenté se sont avérés dépendants du génotype (Fig. 7B). Les expressions du gène MtDehyd au 18e jour de stress hydrique variaient de 0, 07 fois (X6) à 3, 12 fois (Y20) par rapport au gène de référence (Fig. 7B). L'expression du gène MtDehyd a diminué de manière significative sur les mutants X6, Y35 et les plantes témoins Z2 au 18e jour de stress hydrique, tandis qu'une augmentation des niveaux d'expression du même gène a été observée sur les mutants Y20, Y230 et les plantes témoins Z1 aux mêmes intervalles de temps par rapport à avant l'étape de coupe (Fig. 7B). L'expression du gène MtDehyd a été régulée positivement sur le contrôle Z1 (de 2, 42 à 39, 23 fois) et le mutant X6 (de 0, 07 à 0, 45 fois) lorsque le stress hydrique a été prolongé de 18 à 24 jours (Fig. 7B).

La régulation de l'expression du gène MseIF-2 variait en fonction du génotype mutant et de la durée du stress hydrique (Fig. 7C). Par exemple, les mutants Y20, Y30 et Y35 ont montré une augmentation de 1,26 fois, 1,97 fois et 1,71 fois le 18e jour de stress hydrique alors qu'elle a été considérablement réduite à 0,38 fois, 0,04 fois et 0,25 fois le 24e jour de stress hydrique, respectivement (Fig. 7C). D'autre part, l'expression du gène MseIF-2 du mutant X6 a diminué au 18e jour de stress hydrique, puis a augmenté au 24e jour de stress hydrique par rapport à avant la coupe (Fig. 7C). Les niveaux d'expression du gène MseIF-2 ont augmenté de manière significative sur les deux plantes témoins (Z1 et Z2) lorsque le stress hydrique s'est prolongé de 18 à 24 jours, tandis que des diminutions significatives ont été observées sur les mutants à l'exception du mutant X6 (Fig. 7C).

L'extension de la durée du stress hydrique de 18 à 24 jours a entraîné une baisse significative des niveaux d'expression du gène MtRD2 sur les mutants Y20, Y30 et Y35, tandis qu'elle a provoqué des augmentations significatives sur les deux plantes témoins (Z1 et Z2) (Fig. 7D). L'expression du gène MtRD2 la plus élevée (5, 25 fois) et la plus faible (0, 09 fois) a été déterminée sur le mutant Y30 considéré respectivement aux 18e et 24e jours de stress hydrique (Fig. 7D).

L'expression du gène MsNAC a montré une grande variabilité et l'ampleur a changé en fonction du temps et de la durée du stress hydrique chez les témoins et les plantes mutantes (Fig. 7E). Par exemple, il n'y avait pas de différence significative sur la plante témoin Z1 au 18e jour de stress hydrique, tandis qu'une augmentation de 16, 01 fois a été déterminée sur la plante témoin Z2 au même intervalle de temps (Fig. 7E). L'expression du gène MsNAC a montré une diminution significative sur les mutants X6 (100, 4 fois), Y20 (0, 63 fois) et Y35 (0, 55 fois) bien que le mutant Y30 ait montré une augmentation de 1, 44 fois au 18ème jour de stress hydrique (Fig. 7E). Une augmentation considérable de l'expression du gène MsNAC (177,32 fois) a été déterminée sur la plante témoin irriguée (Z1), tandis qu'une forte baisse (diminution de 100,70 fois) a été observée sur le mutant Y30 au 24e jour de stress hydrique par rapport au gène de référence (Fig. 7E).

Le stress hydrique peut entraîner une perte de rendement importante et son ampleur peut varier en fonction non seulement de son intensité et de sa gravité, mais également des stades de développement de la plante14. Comme dans de nombreuses autres espèces de cultures importantes, le stade de germination des graines de luzerne est très vulnérable au stress hydrique15. Par conséquent, de nouveaux cultivars de luzerne qui tolèrent mieux le stress de la sécheresse au stade de la germination sont nécessaires pour minimiser et assurer la stabilité de la production de luzerne. Des rapports antérieurs ont indiqué que les substances osmotiques à poids moléculaire élevé telles que le PEG sont l'une des approches les plus populaires pour le criblage des génotypes cibles à la germination ou à d'autres stades de développement de nombreuses plantes, y compris la luzerne16. Une corrélation positive entre la germination sur des milieux additionnés de PEG et le comportement de la plante entière dans des conditions de déficit hydrique au champ a également été rapportée17. Cependant, les méthodes de criblage en laboratoire qui simulent le manque d'eau et les conditions de stress dû à la sécheresse devraient être fiables pour déterminer les génotypes souhaitables des programmes de sélection réussis18. Le criblage de 340675 graines M3 en présence de 35% de milieu supplémenté en PEG600 dans des conditions de germination in vitro a donné plusieurs candidats tolérants à la sécheresse qui ont montré une croissance radiculaire visible et mesurable alors qu'aucune germination n'a été observée sur les graines témoins dans les mêmes conditions de stress, indiquant que le test de croissance des racines et les conditions de germination utilisées dans l'étude ont permis de déterminer de nouveaux mutants tolérants à la sécheresse capables d'accomplir la division et l'élargissement cellulaires ainsi que la différenciation cellulaire (Fig. 1). Il est bien connu que le PEG ne peut pas traverser la paroi cellulaire en raison de son poids moléculaire élevé et est capable de réguler le potentiel hydrique des cellules embryonnaires en contrôlant le faible débit d'eau du xylème vers les cellules voisines et limite le processus de croissance cellulaire principalement en raison de la perte de turgescence19, ce qui entraîne une altération de l'élongation cellulaire et une inhibition de la germination des graines20. La variation de la germination dans le stress hydrique simulé avec le PEG a également été signalée pour d'autres cultures importantes, notamment la luzerne21, le trèfle16 et le blé22.

La germination des graines est une condition préalable à la réussite de l'établissement des semis pour la tolérance à la sécheresse, mais pas seulement, car les semis exposés au stress hydrique peuvent ne pas survivre pendant la récupération ou conserver certains troubles de croissance à des stades de croissance ultérieurs23. De plus, les résultats des conditions de stress hydrique simulées en laboratoire au stade de la germination doivent être confirmés dans des conditions réelles de déficit hydrique à différents stades de croissance des plantes24. Par conséquent, nous avons encore testé 4 candidats mutants dans des conditions de déficit hydrique établies pendant 24 jours juste après la première coupe au stade bouton floral. Les résultats de la présente étude ont révélé que les mutants M3 présentaient une grande variation et des effets délétères du stress hydrique sur les paramètres agro-morphologiques modifiés en fonction à la fois du génotype mutant et de la durée du stress hydrique appliqué (tableau 1). Tous les mutants avaient de meilleures performances de repousse et toléraient mieux les conditions de stress hydrique que la plante témoin non irriguée (Z2) sur les intervalles de temps donnés, ce qui suggère que la diminution de la photosynthèse et la disponibilité des photoassimilats dans des conditions de stress hydrique sont limitées chez les mutants par rapport à la plante témoin (tableau 1). Des rapports antérieurs indiquaient que le stress hydrique réduisait le nombre de feuilles et la taille des feuilles et fournissait une biomasse plus faible chez la luzerne, bien que le nombre de branches latérales augmentait particulièrement dans des conditions de sécheresse sévère25, ce qui concordait avec les résultats correspondants de cette étude (tableau 1). Les principales raisons de la réduction de la surface foliaire des plantes sous stress hydrique ont été démontrées par la diminution de la pression de turgescence des feuilles, de la température de la canopée et de la disponibilité de photoassimilats en raison de la diminution du taux de photosynthèse dans des conditions de stress hydrique26. La limitation stomatique s'est avérée l'un des principaux facteurs de diminution du taux de photosynthèse dans des conditions de sécheresse légère, bien que des facteurs non stomatiques tels que la diminution de la photosynthèse aient été montrés comme la principale raison de la baisse du taux de photosynthèse dans des conditions de sécheresse sévère.

Un stress hydrique sévère diminue le rendement en foin et la teneur en protéines brutes (PC) et augmente les fibres, ce qui diminue la digestibilité de l'herbe dans la luzerne, bien que l'impact du stress hydrique sur le rendement et la composition de la luzerne puisse varier en fonction du cultivar de luzerne27. Un rapport précédent indiquait que le stress dû à la sécheresse réduisait le rapport entre la PC et la fraction de glucides solubles dans l'eau, ce qui pouvait réduire le surplus d'azote dans les ruminants27. Contrairement aux teneurs en protéines des plantes témoins irriguées (Z1) et non irriguées (Z2), le stress hydrique a augmenté la teneur en protéines des mutants Y20 et Y30 alors qu'il n'a pas changé sur le mutant Y30 (Fig. 2). Ces découvertes suggèrent que les EMS ont provoqué divers types de mutations ponctuelles dans le génome de la luzerne et la voie de biosynthèse des protéines des mutants régulés différemment en réponse au stress hydrique par rapport aux témoins. Étant donné qu'un niveau élevé de protéines est d'une importance cruciale pour l'alimentation des animaux dans des conditions de stress hydrique, les nouveaux mutants déterminés dans cette étude peuvent être utilisés comme une ressource importante pour développer de nouvelles variétés de luzerne tolérantes à la sécheresse dans les programmes de sélection.

Le stress hydrique provoque initialement la formation d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) qui provoquent des dommages oxydatifs en empêchant les fonctions des lipides et des protéines dans les cellules28. Pour prévenir ou diminuer les effets délétères du stress hydrique, les plantes utilisent soit un système de défense antioxydant enzymatique soit non enzymatique29 bien que le système de défense enzymatique soit généralement considéré comme le plus efficace30. Les enzymes antioxydantes empêchent les ROS d'origine naturelle apparues à la suite des activités métaboliques des cellules d'endommager les structures sous-cellulaires28. Il est bien connu que la production de ROS augmente également en réponse au stress hydrique28 et que les enzymes antioxydantes telles que APX, GR et SOD jouent un rôle très important dans la détoxification des ROS et protègent les cellules des dommages potentiels pouvant survenir avec une augmentation des ROS31. La luzerne tolérante à la sécheresse et certaines autres légumineuses deviennent plus tolérantes aux effets négatifs de la sécheresse et des stress salins en augmentant leurs activités enzymatiques antioxydantes 32. Les résultats de cette étude ont montré que les teneurs en SOD, APX et GR des mutants diffèrent nettement du témoin non irrigué (Z2) (Figs. 3, 5, 6). Par exemple, les activités enzymatiques SOD ont diminué le 18e jour de stress hydrique tandis que la même activité enzymatique a augmenté le 24e jour de stress hydrique sur les mutants Y20, Y30 et Y35 par rapport aux témoins et au mutant X6 (Fig. 3). Ces résultats suggèrent qu'une diminution de l'activité enzymatique de la SOD au 18e jour de stress hydrique chez des mutants donnés peut ne pas être directement liée au stress hydrique en soi, mais à des effets de coupe au stade du bouton de floraison (Fig. 3). Il est également possible que les mutants ressentent un stress hydrique plus tard que les plantes témoins et un niveau accru d'activité enzymatique SOD le 24e jour de stress hydrique indique une meilleure tolérance à la sécheresse chez les mutants en raison d'une mutation ponctuelle aléatoire du mutagène EMS (Fig. 3).

Le TBARS est l'un des paramètres les plus courants pour détecter l'oxydation des lipides en réponse au stress1. Le MDA est un produit scindé d'un endoperoxyde d'acides gras insaturés et réagit avec l'acide thiobarbiturique (TBA) pour former le TBARS33. Un stress hydrique prolongé a augmenté les niveaux de TBARS sur les mutants X6 et Y20 tandis que des niveaux similaires de TBARS ont été déterminés sur les mutants Y30, Y35 et le contrôle non irrigué (Z2), suggérant que l'accumulation de MDA et les activités enzymatiques associées peuvent être régulées différemment sur les mutants X6 et Y20 par rapport aux autres mutants6 ou des lacunes importantes apparaissent lorsqu'il est utilisé pour évaluer la peroxydation lipidique sur les mutants apparentés34. L'APX et le GR sont les enzymes clés du cycle ascorbate-glutathion (AsA-GSH) et empêchent l'accumulation d'un niveau toxique de H2O2 dans les organismes photosynthétiques dans des conditions de stress35. Bien qu'il ait été démontré que les activités APX et GR augmentaient dans diverses conditions de stress, y compris la sécheresse chez différentes espèces végétales, ces activités enzymatiques se sont révélées significativement plus faibles sur les mutants que sur les deux plantes témoins de cette étude, ce qui suggère que les dommages oxydatifs ne se sont pas du tout produits sur les mutants ou ont eu moins d'effets délétères chez les mutants par rapport aux plantes témoins.

Les niveaux transcriptionnels et post-transcriptionnels des gènes liés au stress abiotique chez les plantes changent dans des conditions de déficit hydrique36. Les résultats de cette étude ont révélé que le schéma d'expression des gènes MtP5CS, MtDehyd, MseIF-2, MtRD2 et MsNAC liés à la sécheresse était régulé de manière différentielle sur les mutants par rapport aux plantes témoins (Fig. 7). La présence d'une régulation négative de tous les gènes a pu être observée sur le mutant X6 dans les deux intervalles de temps de stress hydrique (18j et 24j), tandis que le schéma de régulation génique des autres mutants a changé en fonction du temps et de la durée du stress hydrique (Fig. 7). Le niveau d'expression du gène MtP5CS au 18e jour de stress hydrique était significativement plus faible chez les mutants que le témoin Z2, à l'exception du mutant X6, tandis qu'un stress hydrique prolongé provoquait une régulation à la baisse du même gène (Fig. 7). Les niveaux d'expression des gènes MtDehyd, MseIF-2 et MtRD2 au 18ème jour de stress hydrique ont été régulés à la hausse sur les mutants Y20, Y30 et Y35, bien que le contrôle Z2 ait montré un niveau d'expression inférieur à celui des mutants sur le même intervalle de temps (Fig. 7). D'autre part, un stress hydrique prolongé (24 jours) a provoqué une régulation négative sévère des gènes MtDehyd, MseIF-2 et MtRD2 sur les mutants, bien que le contrôle Z2 n'ait pas ou moins d'expression que les mutants (Fig. 7). Des régulations à la fois négatives et positives de l'expression du gène MsNAC ont été observées sur les mutants aux deux intervalles de temps (18 jours et 24 jours), tandis que le même gène était significativement régulé à la hausse sur une plante témoin non irriguée (Z2) à des intervalles de temps donnés. Ces résultats ont indiqué que les mutants ont un mode d'action différent en réponse au stress hydrique et que les régulations transcriptionnelles des gènes liés à la sécheresse testés dans cette étude ont fourni une alerte précoce afin que les mutants deviennent plus tolérants au stress hydrique prolongé par rapport au contrôle. Les résultats des expressions géniques liées à la sécheresse ont également montré un accord avec les niveaux d'activités enzymatiques déterminés sur les mutants au 18e jour de stress hydrique (Fig. 7), à l'exception de TBARS. Les plantes témoins ont montré des activités enzymatiques SOD, APX et GR plus élevées que les mutants au 18e jour de stress hydrique, tandis que les mutants Y20 et Y30 avaient des niveaux d'enzymes APX et GR plus faibles au 24e jour de stress hydrique que les plantes témoins (Fig. 7). Ces résultats suggèrent que la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle des mutants avait un mode d'action unique en réponse à des conditions de stress hydrique données par rapport aux témoins.

En conclusion, les résultats de cette étude ont révélé que le criblage des graines de luzerne M3 dans un test de croissance racinaire additionné de 35% de PEG600 a permis de déterminer de nouveaux mutants tolérants à la sécheresse qui ont également toléré les conditions de déficit hydrique appliquées pendant 24 jours après la première coupe au stade bouton floral. Cependant, les nouveaux génotypes de luzerne tolérants à la sécheresse déterminés dans cette étude devraient être évalués davantage dans des conditions de terrain pour le rendement en foin, la qualité nutritionnelle, la capacité de fixation de l'azote et la durabilité.

Nous confirmons que la recherche expérimentale et les études de terrain sur les plantes (cultivées ou mutantes), y compris la collecte de matériel végétal, ont été menées conformément aux directives et législations institutionnelles, nationales et internationales pertinentes. Les graines de 200 g (le poids de mille graines est d'environ 2 g) du cultivar de luzerne (Medicago sativa L.) Bilensoy-80 ont été mutagénisées en utilisant 0,15 % d'éthyl méthane sulfonate (EMS) pendant 12 h comme indiqué dans la littérature37,38. Environ 470 g de graines M2 ont été obtenues à partir des plantes M1 cultivées au champ. Les graines M2 ont été plantées avec un espace brut de 70 cm. Les plantes M2 ont été isolées avec un sac d'isolement au début du stade de bourgeonnement et ont été laissées pour l'autofécondation qui s'est poursuivie environ un mois pendant les périodes de floraison. Les gousses de ces plantes ont été récoltées à la main et ont été détruites manuellement. Au total, 340 675 graines M3 ont été utilisées pour le criblage in vitro en utilisant le test de croissance racinaire indiqué ci-dessous.

Les graines M3 ont été traitées avec de l'éthanol pur pendant 10 min, puis conservées dans une solution contenant du HCl (0,5 ml/100 ml) et du HgCl2 (0,2 g/100 ml) pendant 20 min, puis ont été lavées avec du dH2O stérile pendant 5X. Un milieu MS à demi-force contenant 5 g/L de saccharose, 1 % de gélose et 2 mM de tampon MES à pH 5,7 a été versé dans des boîtes de Pétri en plastique jetables (stériles, 3 × 15 cm) dans des conditions aseptiques et laissé refroidir. Pour induire un stress dû à la sécheresse, 35 % de PEG ont été ajoutés sur le dessus du milieu MS solidifié à demi-force en utilisant la méthode d'infiltration (Fig. 1) 2,39. Les graines du cultivar Bilensoy-80 ont été utilisées comme témoin (Fig. 1B). Les boîtes de Pétri, recouvertes d'un ruban poreux Micropore 3 M, ont été conservées à 4 ° C pendant 48 h afin de rompre la dormance éventuelle des graines. Par la suite, les boîtes de Pétri ont été incubées dans un état d'obscurité constant pendant 3 jours à 25 °C et pendant 4 jours supplémentaires à 25 °C en position verticale dans une chambre de croissance contrôlée des plantes avec un cycle de lumière de 12 h (350 µmol m-2 s-1)/obscurité15,39.

Les graines qui ont germé et ont montré un bon allongement des racines ont été identifiées comme des mutants candidats tolérants à la sécheresse (Fig. 1C, D) et ont été retirées des boîtes de Pétri à l'aide d'une pince et ont été transférées dans des violes (5 × 5 cm) remplies d'un mélange tourbe-perlite (3: 1 v / v) (Fig. 1E). Les violes ont été conservées pendant 14 h de lumière (350 µmol m-2 s-1) jusqu'à ce que les premières vraies feuilles de trèfle soient visibles (Fig. 1F) à 20 ° C et 65% d'humidité. Les semis montrant les premières vraies feuilles (trois folioles, hauteur de semis de 7 à 10 cm) ont ensuite été transférés dans des pots (30 cm × 30 cm) contenant un mélange de tourbe et de perlite (3: 1 v / v) (Fig. 1G). Les plantes ont été cultivées jusqu'au stade du bourgeon dans des conditions de croissance données, comme décrit précédemment (Fig. 1H).

Les candidats mutants ont été réévalués dans des conditions de déficit hydrique appliquées pendant 24 jours après la première bouture au stade bouton. Les mutants M3 ont été cultivés dans des conditions données comme décrit précédemment jusqu'à ce que les premiers boutons floraux de la tige principale soient visibles et ont été coupés à une hauteur de 5 cm (Fig. 1H). Les pots ont ensuite été irrigués jusqu'à ce qu'ils aient atteint la capacité en eau du champ et ont été laissés pendant 24 h pour permettre à l'eau de s'écouler6,40. Aucune irrigation n'a été appliquée à ces pots pendant un total de 24 jours et les échantillons de feuilles ont été prélevés au 0 (témoin, avant coupe), 18 et 24 du stress hydrique, et ont été immédiatement stockés à - 80 ° C jusqu'à ce qu'ils soient utilisés pour l'analyse physiologique et moléculaire. Les paramètres agro-morphologiques ont également été déterminés à des intervalles de temps donnés de stress hydrique et les résultats ont été comparés avec des témoins irrigués (Z1) et non irrigués (Z2)6.

La longueur de la tige principale, l'épaisseur de la tige principale, le nombre de branches, le nombre de feuilles, la longueur et la largeur des folioles moyennes et les températures du couvert végétal ont été déterminés les 18e et 24e jours de stress hydrique. Cinq gousses choisies au hasard de chaque plante ont été utilisées pour déterminer le rendement en graines par gousse et la quantité de graines M4 obtenues à partir de chaque plante (g/plante) a été déterminée. L'épaisseur de la tige principale a été déterminée entre la 2e et la 3e branche de la tige principale en mesurant avec un pied à coulisse de 0,1 mm. La longueur et la largeur des folioles médianes ont été déterminées à partir des 4e et 5e feuilles de la tige principale6. Avant de prélever des échantillons de feuilles, les températures des plantes ont été déterminées à l'aide d'un thermomètre infrarouge marqué au laser (IR988) à partir de 3 points différents appartenant aux parties inférieure, médiane et supérieure de chaque plante.

Les tissus existants aux 0e (témoin, avant coupe), 18e et 24e jours du stress ont été utilisés pour déterminer la teneur en protéines, les niveaux d'isoenzyme superoxyde dismutase (SOD) et de substances réactives à l'acide thiobarbiturique (TBARS), les activités enzymatiques de l'ascorbate peroxydase (APX) et de la glutathion réductase (GR) avec trois réplications biologiques.

L'étalon d'albumine sérique bovine (BSA) selon la méthode de Bradford a été utilisé pour déterminer la teneur en protéines solubles totales41. La teneur en complexe acide thiobarbutyrique (TBA)-MDA formé par cette méthode a été déterminée à A532 et A600 nm dans le spectrophotomètre. La teneur en MDA dans les tissus a été calculée à l'aide de la formule suivante : teneur en MDA = [(A532 - A600) × volume d'extrait (ml)]/[155 mM/cm × quantité d'échantillon (mg)]. L'activité enzymatique SOD a été déterminée par spectrophotométrie à 560 nm selon la méthode basée sur la réduction photochimique du nitrobluetetrazolium (NBT)42. L'activité enzymatique APX a été déterminée sur la base de la littérature donnée43. L'activité totale de l'enzyme APX dans les tissus a été calculée à partir du taux initial (nmol.ascorbate.min-1.mg protéine-1) en utilisant le coefficient d'extinction de l'ascorbate (2,8 mM.cm-1). L'activité enzymatique GR a été réalisée comme indiqué dans la littérature44. L'activité enzymatique GR totale des échantillons a été calculée à partir de la vitesse initiale de la réaction (nmolNADPH.min-1.mg protéine-1) après soustraction de l'oxydation non enzymatique à l'aide du coefficient d'extinction du NADPH (6,2 mM cm-1).

L'isolement total de l'ARN des échantillons de feuilles a été réalisé en utilisant le kit d'extraction d'ARN commercial (Vivantis GF-1) selon le protocole spécifié par la société. La qualité des ARN isolés a été déterminée par mesure spectroscopique à 260/280 nm avec un dispositif nanodrop et a également été confirmée sur gel d'agarose à 2% à l'aide d'un système d'électrophorèse sur gel dédié pour éviter différentes contaminations enzymatiques (Fig. 1 supplémentaire).

Les ADNc premier brin ont été synthétisés avec 4 µl de kit de synthèse d'ADNc premier brin RevertAid d'ARN total (Thermo Fisher Scientific, USA). Les différences d'expression de gènes spécifiques au stress hydrique ont été détectées par RT-qPCR (StepOne 7500, Applied bioscience) à l'aide des amorces spécifiques aux gènes pertinentes (tableau supplémentaire 1). Les amorces de tous les gènes ont été testées pour déterminer les températures de liaison optimales et le statut d'amplicon avant l'analyse RT-qPCR. De plus, les spécificités des amorces et des produits de PCR ont également été testées et ont été confirmées par des analyses de courbe de fusion effectuées à la fin de l'analyse RT-qPCR. Les conditions de RT-qPCR ont été appliquées à 95 °C pendant 15 min, suivies de 40 cycles de 95 °C pendant 40 s, 55 °C pendant 40 s et 72 °C pendant 30 s. À la fin de la réaction PCR, l'analyse de la courbe de fusion a été effectuée à 58–92 °C. Une analyse de la cinétique de dissociation a été réalisée en fin d'expérience pour vérifier la spécificité de l'annelage.

En tant que gènes domestiques, les gènes de référence Ms18srRNA et MsActin ont été testés simultanément dans les analyses RT-qPCR6,45. Étant donné que le gène Ms18srRNA s'est avéré plus stable et a montré moins de variation entre les répétitions techniques, il a été utilisé comme contrôle interne dans les amplifications RT-qPCR et les résultats ont été comparés avec la méthode 2-delta-delta Ct46. Les directives MIQE ont été suivies pour toutes les expériences de qPCR47.

Les niveaux d'expression des gènes ont été déterminés sur les tissus foliaires prélevés aux 0ème (témoin, avant coupe), 18ème et 24ème jours de stress hydrique avec 3 réplications techniques. Les réglages recommandés par le manuel de l'appareil (StepOne 7500, Applied bioscience) ont été utilisés pour déterminer les valeurs seuils critiques (Ct) des amplicons. Les valeurs d'écart type delta Ct parmi les réplications techniques ≥ 0,25 ont été répétées. Dans les calculs de la quantité relative (2-delta-delta Ct), la valeur RQ (quantification relative) dans l'expression du gène de contrôle a été acceptée comme 1, et plus de 2 fois ou moins de 0,5 fois les changements d'expression des échantillons ont été utilisés dans l'interprétation des résultats. De plus, un graphique d'indicateurs logarithmiques a été utilisé dans la création de graphiques d'expression génique, notamment pour voir les changements d'expression inférieurs à 0,5 fois par rapport au gène de référence.

Les données agro-morphologiques (longueur et largeur des folioles médianes, températures du couvert végétal et nombre de graines par gousse) ont été soumises à une ANOVA unidirectionnelle à l'aide du programme SAS48. Les paramètres physiologiques ont été analysés selon les méthodes des références pertinentes spécifiées dans la section méthode. Les différences entre les moyennes des données ont été testées avec le test LSD au niveau P < 0,05. Les données moléculaires ont été normalisées selon la méthode 2-delta-delta Ct en utilisant le gène Ms18srRNA comme contrôle interne, et les niveaux d'expression des gènes pertinents ont été déterminés46,49. Les différences significatives au niveau p < 0,05 ont été indiquées par des lettres différentes au-dessus des colonnes de chiffres.

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Le soutien financier de cette étude a été fourni par le Conseil de la recherche scientifique et technologique de Turquie (TUBITAK) avec la subvention de recherche TOVAG-116O417. Nous tenons à remercier le Dr Melih Taskin qui nous a permis d'utiliser la RT-qPCR. Nous voudrions également remercier Huseyin Keles et Semun Tayyar pour leur aide sur la récolte et l'autofécondation sur le terrain, respectivement. Nous tenons également à remercier Enes Gokhan Yilmaz, Beste Celep, Erman Cavusoglu et les membres anonymes du laboratoire qui ont aidé pendant les expériences de laboratoire et la croissance des mutants dans des conditions de contrôle.

Département de biotechnologie agricole, Faculté d'agriculture, Université Canakkale Onsekiz Mart, Campus Terzioglu, 17000, Canakkale, Turquie

Iskender Tiryaki, Ugur Sari et Selcuk Cetin

Département de biologie, Faculté des arts et des sciences, Université Canakkale Onsekiz Mart, 17100, Canakkale, Turquie

Okan Acar

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L'informatique a conçu l'idée, accordé un soutien financier, planifié les expériences, effectué l'analyse, interprété les données, conçu les figures et rédigé le manuscrit. Dépistage conçu aux États-Unis et analyse RT-qPCR. SC a collecté des données relatives aux paramètres agro-morphologiques et a fourni une assistance technique pendant la recherche et OA a effectué des analyses enzymatiques. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit.

Correspondance à Iskender Tiryaki.

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts.

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Réimpressions et autorisations

Tiryaki, I., Sari, U., Cetin, S. et al. Amélioration de la tolérance à la sécheresse des mutants mutagénisés EMS de la luzerne (Medicago sativa L.) par criblage in vitro au stade de la germination. Sci Rep 12, 12693 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16294-0

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Reçu : 15 février 2022

Accepté : 07 juillet 2022

Publié: 26 juillet 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-16294-0

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