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Sep 19, 2023

ARTICLE RETRACTE : Un édulcorant alimentaire naturel avec anti

Oncogenèse volume 5, page

Oncogenèse volume 5, page e217 (2016)Citer cet article

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Cet article a été retiré le 16 mars 2023

Un rectificatif à cet article a été publié le 10 avril 2017

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Le mogroside V est un triterpénoïde isolé de la plante médicinale traditionnelle chinoise Siraitia grosvenorii. Mogroside V a un haut degré de douceur et un faible contenu calorifique. Ici, nous avons découvert que le mogroside V possède une activité inhibitrice de la croissance tumorale dans des modèles in vitro et in vivo de cancer du pancréas en favorisant l'apoptose et l'arrêt du cycle cellulaire des cellules cancéreuses du pancréas (cellules PANC-1), qui peuvent en partie être médiés par la régulation de la voie de signalisation STAT3. Ces résultats ont été confirmés in vivo dans un modèle murin de xénogreffe de cancer du pancréas. Dans les tumeurs de xénogreffe, Ki-67 et PCNA, les marqueurs les plus couramment utilisés de la prolifération des cellules tumorales, ont été régulés à la baisse après l'administration intraveineuse de mogroside V. Les essais de marquage de l'extrémité terminale de la désoxynucléotidyl transférase dUTP ont montré que le traitement au mogroside V favorisait l'apoptose des cellules cancéreuses pancréatiques dans les tumeurs de xénogreffe. De plus, nous avons constaté que le traitement au mogroside V réduisait de manière significative l'expression des vaisseaux sanguins marqués au CD31 et du facteur de croissance endothélial vasculaire du facteur pro-angiogénique dans les xénogreffes, ce qui indique que le mogroside V pourrait limiter la croissance des tumeurs pancréatiques en inhibant l'angiogenèse et en réduisant la densité vasculaire. Ces résultats démontrent donc que le mogroside V, un composé naturel au goût sucré, peut inhiber la prolifération et la survie des cellules cancéreuses du pancréas en ciblant de multiples cibles biologiques.

Le cancer représente une menace importante pour la santé humaine et affecte gravement la qualité de vie. Par exemple, les patients atteints de cancer éprouvent de la fatigue, de la faiblesse et des niveaux élevés de douleur. De plus, les médicaments chimiothérapeutiques utilisés dans le traitement des cancers ont de nombreux effets secondaires qui affectent également gravement la qualité de vie. Par conséquent, il est particulièrement important d'augmenter l'efficacité des médicaments anticancéreux et de réduire les effets secondaires de la chimiothérapie pour assurer un cours de chimiothérapie durable et efficace.

La chimiothérapie est l'une des thérapies antitumorales les plus importantes. Les médicaments chimiothérapeutiques peuvent grandement améliorer la qualité de vie et prolonger la survie, et donc la recherche de médicaments chimiothérapeutiques à haute efficacité et à faible toxicité est un axe majeur de la recherche en oncologie. Bien que le criblage de composés pharmacologiquement actifs dans les plantes soit une approche importante pour le développement de nouveaux médicaments, les plantes susceptibles de contenir des composés pharmacologiquement actifs sont largement distribuées et nombreuses, et les composés sont complexes. Par conséquent, le dépistage aléatoire des médicaments dérivés des plantes est laborieux. La médecine traditionnelle chinoise utilise des plantes dont l'efficacité clinique a été prouvée depuis des milliers d'années, fournissant ainsi une ressource importante pour le développement de médicaments.1, 2 Par conséquent, le criblage de composés uniques qui ont une efficacité particulièrement élevée dans les plantes médicinales chinoises peut être une approche importante pour développer de nouvelles thérapies.

Parmi les plantes couramment utilisées en médecine traditionnelle chinoise figure Siraitia grosvenorii, une plante endémique en Chine qui est principalement cultivée dans la province du Guangxi, qui représente plus de 90 % de la production mondiale de S. grosvenorii. En 1997, le ministère chinois de la Santé a approuvé les saponines de S. grosvenorii comme édulcorant dans divers types d'aliments. Les saponines de S. grosvenorii sont les principaux composés édulcorants de S. grosvenorii et sont plusieurs centaines de fois plus sucrées que le saccharose.

S. grosvenorii fait partie du premier groupe de médicaments « médicinaux et comestibles » inclus dans la Pharmacopée de la République populaire de Chine,3 qui énumère les principaux effets de S. grosvenorii comme « dégageant de la chaleur et humidifiant les poumons, bénéfique pour le pharynx et la voix, facilitant les selles et agissant comme un laxatif. » Actuellement, les études sur S. grosvenorii se concentrent sur son potentiel antioxydant4, 5 anti-inflammatoire6 et réducteur de lipides sanguins et de sucre7. Cependant, jusqu'à présent, les nombreuses études sur S. grosvenorii n'ont pas été suffisamment complètes. Notamment, ils n'ont pas réussi à fournir un mécanisme d'action clair et à caractériser les effets pharmacologiques complets de cette plante médicinale. En particulier, l'utilisation de S. grosvenorii dans le développement de médicaments contre le cancer du pancréas n'a pas été explorée.

Le cancer du pancréas est une maladie maligne qui affecte le métabolisme du glucose.8, 9 Ainsi, les patients atteints d'un cancer du pancréas doivent éviter une consommation excessive de sucre, car une consommation excessive chronique de sucre augmente le risque de cancer du pancréas. Cependant, la plupart des gens consomment des aliments et des boissons sucrés au quotidien. Ainsi, un moyen de fournir un traitement anticancéreux avec un édulcorant cliniquement approuvé serait particulièrement bénéfique pour les patients atteints d'un cancer du pancréas. Ici, il a été observé que le mogroside V extrait de S. grosvenorii inhibait la prolifération et la survie des cellules cancéreuses du pancréas par la voie STAT3 à la fois in vivo et in vitro. Ces résultats indiquent que le mogroside V peut être un médicament anticancéreux prometteur pour une utilisation quotidienne avec relativement peu d'effets secondaires.

Nous avons examiné les effets du mogroside V (figure 1a) sur la prolifération des cellules PANC-1 et d'autres types de tumeurs dans une culture cellulaire liquide à l'aide du test MTT. Comme le montre la figure 1b, le mogroside V a inhibé la prolifération des cellules cancéreuses pancréatiques et d'autres types de cellules tumorales de manière dépendante de la dose et du temps, et a montré très peu de cytotoxicité contre la lignée de cellules épithéliales non tumorigènes L02. Pour déterminer plus avant si les effets anti-prolifératifs du mogroside V étaient liés à l'induction de l'apoptose et/ou de la nécrose, les cellules traitées au mogroside V ont été analysées avec des tests de marquage terminal désoxynucléotidyl transférase dUTP nick end (TUNEL). Après 24 h de traitement avec le mogroside V, le pourcentage de cellules positives au TUNEL a augmenté de manière concentration-dépendante, allant de 2,91 % dans les cellules témoins non traitées à 92,25 % dans les cellules traitées avec 250 μmol/l de mogroside V (Figure 1c).

Le mogroside V inhibe la prolifération et induit l'apoptose dans les cellules cultivées. ( a ) Structure chimique du mogroside V extrait de S. grosvenorii. ( b ) Graphique des résultats du test MTT indiquant le taux d'inhibition de la prolifération cellulaire dans PANC-1 et d'autres types de cellules tumorales traitées avec du mogroside V. ( c ) Images représentatives de cellules plaquées sur des lames pour les tests d'apoptose de la réaction TUNEL. Le pourcentage de cellules subissant l'apoptose a augmenté avec l'augmentation des concentrations de mogroside V. Les résultats ont été obtenus dans trois expériences indépendantes.

Pour étudier plus avant l'inhibition de la prolifération et de la viabilité cellulaires par le mogroside V, l'apoptose et la distribution du cycle cellulaire des cellules PANC-1 traitées avec des concentrations de mogroside V allant de 0 à 250 μmol/l ont été examinées par cytométrie en flux. Les tests de cytométrie en flux de l'annexine V ont révélé que le mogroside V provoquait l'apoptose dans les cellules PANC-1. Comme illustré sur les figures 2a et b, le mogroside V a induit l'apoptose dans les cellules PANC-1 d'une manière dépendante de la concentration et du temps. Nous avons en outre découvert que z-VAD-fmk, un inhibiteur général de la caspase, inhibait l'apoptose des cellules PANC-1 induite par un traitement au mogroside V pendant 48 h (Figure 2c). De plus, une augmentation dépendante de la concentration de mogroside V dans le rapport G0/G1 a été observée, atteignant une augmentation de 1,7 fois après exposition à la dose la plus élevée (250 μmol/l) par rapport à celle des cellules non traitées (Figure 2d).

Apoptose et analyse du cycle cellulaire des cellules PANC-1 traitées avec du mogroside V. (a) Parcelles représentatives de cytométrie en flux à partir d'essais d'annexine V indiquant que le mogroside V a induit l'apoptose dans les cellules PANC-1 d'une manière dépendante de la concentration et (b) d'une manière dépendante du temps. (c) Les cellules PANC-1 ont été traitées avec ou sans mogroside V (20 μmol/l) pendant 48 h en présence ou en l'absence de l'inhibiteur d'apoptose zVAD (20 μmol/l). ( d ) Graphique indiquant les étapes du cycle cellulaire analysées par cytométrie en flux. Le pourcentage de cellules en phase G0/G1, S ou G2/M du cycle cellulaire est indiqué. Une augmentation de la population G0-G1 a été observée dans les cellules traitées au mogroside V. Les résultats ont été obtenus dans trois expériences indépendantes.

La voie STAT3 joue un rôle important dans la croissance, la prolifération et la survie des cellules et est impliquée dans plusieurs types de cancers humains.10, 11 Nous avons donc évalué l'effet du traitement au mogroside V sur cette voie de signalisation dans les cellules PANC-1 par des tests Western blot. Nous avons constaté que le niveau de STAT3 phosphorylé (p-STAT3) dans les cellules PANC-1 était réduit après un traitement avec le mogroside V pendant 24 h (Figure 3). Nous avons en outre examiné si le mogroside V modulait l'expression des protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire et les voies apoptotiques situées en aval de la voie STAT3. L'expression des inhibiteurs de la cycline kinase CDKN1A (p21WAF1) et CDKN1B (p27),12, 13, 14 qui sont associés à l'arrêt du cycle cellulaire en phase G0-G1,15 a été augmentée par le mogroside V de manière dose-dépendante après 24 h. En revanche, l'expression des régulateurs pro-prolifératifs du cycle cellulaire CCND1 (cycline D1), CCNE1 (cycline E1) et CDK2 a diminué après le traitement au mogroside V.16 En outre, l'expression des protéines anti-apoptotique BCL2L1 et BCL2 a diminué, tandis que celle des protéines pro-apoptotique CASP3 et BAX a augmenté après le traitement de 24 h au mogroside V. De plus, le mogroside V a supprimé la phosphorylation des kinases en amont de STAT3, y compris celle de JAK2 et TYK2 (figures 3c et d).

L'effet du mogroside V sur la voie STAT3. Les cellules PANC-1 ont été exposées à diverses concentrations de mogroside V pendant 24 h et les protéines cibles ont été détectées par immunotransfert à l'aide d'anticorps spécifiques. ( a ) La phosphorylation de STAT3 (p-STAT3) et l'expression de protéines en aval de la voie STAT3 ont été supprimées dans les cellules traitées au mogroside V. ( b ) Une représentation provisoire de la régulation de la voie de signalisation STAT3 dans les cellules PANC-1 par le mogroside V. ( c ) La phosphorylation de STAT3 en p-STAT3 et l'expression protéique de STAT3, P-JAk2, JAK2, P-TYK2 et TYK2 dans les cellules PANC-1 traitées au mogroside V et les cellules MiaPaCa-2 ( d ) ont été examinées à l'aide d'un transfert Western. L'expression de la bêta-actine a servi de contrôle de charge. Les résultats ont été obtenus dans trois expériences indépendantes.

Pour déterminer la capacité du mogroside V à inhiber la croissance tumorale in vivo, nous avons évalué l'activité antitumorale du mogroside V contre les tumeurs PANC-1 dans un modèle de xénogreffe de souris nude en injectant par voie intraveineuse des souris expérimentales avec différentes doses de mogroside V 3 jours/semaine pendant 5 semaines. La croissance tumorale a été significativement inhibée chez les souris traitées avec le mogroside V à toutes les doses évaluées par rapport à celle chez les souris témoins (Figure 4a). Les souris ont été sacrifiées et les tumeurs ont été anatomisées 35 jours après la xénogreffe. Le volume tumoral moyen chez les souris témoins était de 278,6 ± 0,03 mm3, contre 56,4 ± 0,11 mm3 chez les souris traitées au mogroside V à forte dose (diminution de 79,7 % ; P < 0,001). Le poids global de la tumeur dans le groupe témoin était de 32, 2 ± 1, 4 g, alors qu'il n'était que de 9, 2 ± 1, 8 g chez les souris ayant reçu le traitement à haute dose de mogroside V (diminution de 71, 4%; figure 4b). Les taux de survie globale ont été estimés par la méthode de Kaplan-Meier, confirmant l'association entre le traitement au mogroside V et la survie (voir les figures 4c pour la courbe de survie). Nos données ont démontré que le mogroside V pouvait non seulement augmenter la survie des souris utilisées pour le modèle de cancer du pancréas in vivo, mais également celle des souris utilisées pour les modèles de xénogreffe in vivo de cancer du côlon HT29 et de cancer du larynx HEP-2 (Figure supplémentaire S1). Les résultats de ces expériences de xénogreffe étaient cohérents avec les données in vitro présentées à la figure 1b et indiquaient que le mogroside V pourrait être un puissant inhibiteur de la croissance tumorale.

Le mogroside V inhibe la croissance tumorale des cellules PANC-1 dans un modèle tumoral de xénogreffe de souris. Des souris ont été implantées avec des cellules PANC-1 et ont été réparties au hasard en cinq groupes : un groupe témoin, NC (solution saline normale) et trois groupes de traitement recevant des doses de 2, 10 ou 30 mg/kg pc de mogroside V trois fois par semaine. ( a ) Le volume moyen des xénogreffes tumorales dans les cinq groupes, mesuré avec des pieds à coulisse après que les souris ont été tuées et que la tumeur a été anatomisée 35 jours après le traitement. (b) Le poids moyen des xénogreffes tumorales dans les cinq groupes. Le poids de la tumeur était significativement plus faible dans les groupes de traitement au mogroside V que dans les groupes contrôle et NC. Pour l'analyse statistique, les souris traitées au mogroside V ont été comparées aux souris témoins du véhicule en utilisant les tests t de Student ; **P<0,01 et ***P<0,001 versus les valeurs témoins. ( c ) L'analyse de survie de Kaplan – Meier a montré que le traitement au mogroside V était significativement corrélé à la survie globale (P <0, 01, en utilisant le test du log-rank, P <0, 05 était considéré comme significatif).

Les mécanismes potentiels sous-jacents à l'inhibition de la croissance tumorale par le mogroside V in vivo ont été évalués avec des tests IHC détectant la mort cellulaire, la prolifération cellulaire et l'angiogenèse. La coloration TUNEL des coupes de tissus (Figure 5) a révélé que davantage de cellules étaient positives au TUNEL dans les groupes de mogroside V à faible dose (57,8 % TUNEL-positif), à dose modérée (73,1 % TUNEL-positif) et à forte dose (82,1 % TUNEL-positif) par rapport aux cellules du groupe témoin (5,2 % TUNEL-positif), indiquant que le mogroside V induisait un taux élevé d'apoptose dans les cellules tumorales PANC-1.

Analyse immunohistochimique de l'apoptose tumorale de xénogreffe de cellules PANC-1. Les cellules ont été colorées en utilisant la méthode TUNEL et ont été notées pour l'apoptose par comparaison avec le véhicule témoin. Les images de gauche illustrent le niveau de coloration TUNEL dans les cellules PANC-1 comprenant la tumeur dans les groupes de traitement témoin et mogroside V. Les graphiques de droite indiquent une augmentation de la coloration TUNEL dépendante de la concentration de mogroside V, déterminée en comptant les coupes de tissus de huit tumeurs indépendantes. Pour l'analyse statistique, les souris traitées au mogroside V ont été comparées aux souris témoins du véhicule en utilisant les tests t de Student ; ***P<0,001 par rapport aux valeurs témoins.

Nous avons ensuite évalué la prolifération cellulaire dans les tumeurs en utilisant l'IHC pour détecter PCNA et Ki-67. Le nombre de cellules exprimant ces marqueurs a été significativement diminué dans tous les groupes de traitement au mogroside V par rapport à celui des groupes témoins (P < 0,001) (Figure 6). L'expression de l'ARNm de PCNA et de Ki-67 in vivo a été évaluée par des tests de PCR en temps réel (RT-PCR) (Figure 6). Le mogroside V a clairement réduit l'expression de l'ARNm de PCNA et de Ki-67, ce qui était conforme aux données IHC présentées à la figure 6 (P <0, 001). Prises ensemble, ces données indiquent que le mogroside V inhibe la survie et la prolifération des cellules tumorales.

L'effet du mogroside V sur l'expression de PCNA et de Ki-67 dans les tumeurs de xénogreffe PANC-1. ( a ) Images de coloration immunohistochimique et analyse RT – PCR indiquant que le mogroside V inhibe l'expression de PCNA. ( b ) Images de coloration immunohistochimique et d'analyse RT – PCR indiquant que le mogroside V inhibait l'expression de PCNA. Les données représentent les moyennes ± sd L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du test t de Student ; ***P<0,001 par rapport aux valeurs témoins.

Enfin, nous avons déterminé si le mogroside V affectait la densité microvasculaire (MVD) et l'angiogenèse dans les tumeurs. Comme le montre la figure 7a, l'expression du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF) du facteur pro-angiogénique était plus faible dans les groupes de traitement au mogroside V (22,82 % des cellules étaient VEGF+ dans le groupe à la dose la plus élevée) que dans le groupe témoin (64,71 % des cellules étaient positives ; P <0,001) ; ainsi, il y avait 64,73 % moins de cellules exprimant le VEGF après le traitement avec la dose la plus élevée de mogroside V. Pour examiner l'effet du traitement au mogroside V sur le MVD dans les tumeurs, les vaisseaux sanguins ont été marqués avec CD31 (Figure 7b) et le MVD a été calculé selon la méthode de Weidner. La valeur MVD (Figure 7c) dans le groupe traité au mogroside V (4, 11) était significativement inférieure à celle du groupe témoin (37, 23; diminution de 88, 96%, P <0, 001). Ces résultats ont montré que le mogroside V inhibait l'angiogenèse tumorale de manière dose-dépendante.

Détermination de l'angiogenèse par analyse immunohistochimique de l'expression du VEGF et du CD31. L'expression des protéines VEGF et CD31 était significativement régulée négativement dans les tumeurs PANC-1. ( a ) Coloration immunohistochimique du VEGF dans les tumeurs de xénogreffe de chacun des groupes de traitement indiqués de contrôle et de mogroside V. ( b ) Images représentatives de la coloration immunohistochimique de CD31 dans les tumeurs de xénogreffe de chacun des groupes de traitement indiqués de contrôle et de mogroside V. ( c ) Graphique des mesures MVD dans des sections de tumeurs de xénogreffe telles que déterminées par l'expression de CD31. Les données représentent les moyennes ± sd L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du test t de Student. *P<0,05, **P<0,01 et ***P<0,001 versus les valeurs témoins.

Dans cette étude, une approche cellulaire et moléculaire a été utilisée pour déterminer les mécanismes sous-jacents à la division cellulaire et à la régulation de la survie tumorale PANC-1 par le mogroside V. Nos résultats ont clairement démontré que le traitement au mogroside V inhibait la croissance des cellules tumorales, induisait l'apoptose et provoquait une régression tumorale. De plus, le mogroside V a inhibé non seulement la prolifération des cellules cancéreuses pancréatiques, mais également celle des cellules cancéreuses U937 et A549. En revanche, le mogroside V à des concentrations équivalentes a eu un effet minimal sur les cellules hépatiques humaines normales (L02) (Figure 1b). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que le mogroside V pourrait être moins toxique pour les cellules normales que pour les cellules cancéreuses.

Jusqu'à présent, les cibles biochimiques du mogroside V n'avaient pas été élucidées. Ici, en utilisant le Western blot, nous avons démontré que le mogroside V régulait l'expression protéique de STAT3. De plus, le mogroside V a inhibé les cibles en aval de la voie STAT3 qui favorisent la prolifération cellulaire (CCND1, CCNE1 et CDK2), tout en régulant à la hausse les inhibiteurs du cycle cellulaire (CDKN1A et CDKN1B). Ces effets sont conformes à notre découverte d'un arrêt du cycle cellulaire G0-G1 dépendant de la dose dans les cellules PANC-1 traitées au mogroside V. partiellement bloqué par l'inhibiteur de caspase z-VAD-fmk (Figure 2c), ce qui suggère que l'apoptose induite par le mogroside V peut en partie être médiée par la voie de la caspase.

Nos résultats obtenus à l'aide des modèles de xénogreffe PANC-1 ont indiqué que le mogroside V inhibait puissamment la croissance tumorale in vivo. De plus, comme nos découvertes in vitro, le mogroside V a également réduit la viabilité et la prolifération cellulaires in vivo et réduit p-STAT3 dans les tumeurs PANC-1 de manière dose-dépendante (Figure supplémentaire S2). Les tests TUNEL ont révélé que le mogroside V induisait fortement l'apoptose. L'activité proliférative dans les tumeurs de xénogreffe a été évaluée par IHC pour Ki-67 et PCNA. Ki-67 est un marqueur de prolifération cellulaire qui est exprimé dans toutes les phases du cycle cellulaire, à l'exception de la phase G0.22, 23 PCNA, une protéine auxiliaire delta de l'ADN polymérase de 36 kD impliquée dans la prolifération des cellules néoplasiques et non néoplasiques,24, 25 est spécifiquement exprimée dans les noyaux cellulaires en prolifération et est couramment utilisée pour mesurer la prolifération des cellules tumorales. L'expression de Ki-67 et de PCNA a été réduite dans les tumeurs de xénogreffe PANC-1 dans tous les groupes de traitement au mogroside V par rapport à celle des groupes témoins et correspondait à des réductions du poids de la tumeur. Ainsi, le mogroside V peut agir pharmacologiquement en inhibant la prolifération des cellules PANC-1, tout en induisant également l'apoptose, limitant ainsi par la suite la croissance tumorale pancréatique.

Enfin, nous avons constaté que l'expression du VEGF et le MVD étaient diminués dans les tumeurs de xénogreffe PANC-1. Le VEGF joue un rôle important dans l'angiogenèse dans les tumeurs et les tissus sains.26, 27 Ces données suggèrent donc que le mogroside V peut empêcher la croissance tumorale pancréatique en inhibant l'angiogenèse par un mécanisme dépendant du VEGF. Par conséquent, cela conduirait à une diminution de la MVD et, par conséquent, à une diminution de la croissance tumorale. STAT3 est un médiateur essentiel de la transcription du VEGF en se liant directement au promoteur du VEGF, induisant ainsi l'angiogenèse.28, 29 Notre étude a montré que le mogroside V inhibait de manière significative l'activation de la protéine STAT3 dans les cellules cancéreuses PANC-1 en même temps que la réduction des niveaux de protéine VEGF in vivo. Cette découverte suggère que les effets anti-angiogéniques du mogroside V peuvent être dus à la capacité du mogroside V à empêcher l'activation de STAT3.

Notre étude était limitée par le fait que nous n'avons pas exploré les effets d'une surexpression stable de STAT3 ou d'une délétion de STAT3 dans les cellules PANC-1 utilisées comme xénogreffes tumorales. L'efficacité du traitement au mogroside V dans ces conditions n'est pas connue et fera l'objet de nos futures études.

En conclusion, nous avons découvert, grâce à des expériences in vitro et in vivo, que le mogroside V inhibait la prolifération des cellules cancéreuses pancréatiques et favorisait l'apoptose tumorale. De plus, le mogroside V a interféré avec l'angiogenèse dans les tumeurs pancréatiques. Par conséquent, nos résultats suggèrent que le mogroside V pourrait être un composé anticancéreux potentiel qui agit sur la voie STAT3. De plus, nous avons démontré que le mogroside V pouvait non seulement empêcher la progression tumorale in vivo mais aussi augmenter la survie des souris, indiquant que ce composé naturel pourrait posséder une activité thérapeutique potentielle. Étant donné que le mogroside V est un édulcorant naturel qui a été approuvé par la Food and Drug Administration des États-Unis, il peut être utilisé pour la consommation quotidienne comme additif dans les aliments et les boissons pour prévenir ou traiter le cancer du pancréas.

Le Mogroside V a été acheté chez Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Tous les autres réactifs ont également été achetés auprès de Sigma-Aldrich, sauf indication contraire.

La lignée cellulaire d'adénocarcinome pancréatique humain PANC-1 a été obtenue auprès de l'Institut de biologie cellulaire de Shanghai (Shanghai, Chine). Les cellules PANC-1 ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco additionné de 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (Gibco, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml de streptomycine et 100 U/ml de pénicilline sous une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 à 37 °C. Les lignées cellulaires d'adénocarcinome pancréatique humain MiaPaCa-2 et CFPAC-1, l'adénocarcinome pulmonaire A549, les cellules hépatiques humaines normales U937 et L02 ont été obtenues auprès de l'Institut de biologie cellulaire de Shanghai. Les cellules MiaPaCa-2 et CFPAC-1 ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco et les cellules A549, U937 et L02 ont été cultivées dans du RPMI1640. Tous les milieux ont été supplémentés avec du sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (10 %), 100 μg/ml de streptomycine et 100 U/ml de pénicilline. Les cellules ont été maintenues à 37°C avec 5% de CO2.

Les cellules ont été ajoutées à des plaques de culture cellulaire à 96 puits à une concentration initiale de 1 × 104 cellules/ml et ont été incubées avec les concentrations indiquées de mogroside V. Après 24 ou 72 h d'incubation, une solution de MTT (5 mg/ml) a été ajoutée aux puits et les cellules ont été incubées pendant encore 4 h. Le milieu de croissance a été retiré et les cristaux de formazan formés par oxydation du colorant MTT ont été analysés en mesurant l'absorbance à 490 nm à l'aide d'un lecteur ELISA.30, 31

Les cellules ont été marquées pour les ruptures de brins d'ADN apoptotiques par une réaction TUNEL à l'aide du kit de détection de mort cellulaire in situ (POD; Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) pour déterminer le pourcentage de cellules subissant une apoptose induite par le mogroside V, et ont été incubées avec de la peroxydase antidigoxigénine pendant 30 min en utilisant un substrat DAB. Les cellules apoptotiques ont été visualisées par microscopie optique (Olympus, Tokyo, Japon). Pour quantifier les cellules apoptotiques, le pourcentage de cellules TUNEL-positives dans une population de cellules cancéreuses de 300 cellules a été déterminé dans cinq champs aléatoires par lame de verre.

L'état du cycle cellulaire a été déterminé par cytométrie en flux. Les cellules PANC-1 ont été analysées pour les altérations de leur cycle cellulaire après un traitement avec du mogroside V pendant 24 h. Les cellules utilisées pour les expériences de cytométrie en flux étaient à la fois des cellules flottantes et adhérentes. Après que les cellules ont été fixées avec du méthanol à 70 %, elles ont été traitées avec de la RNase A et ont été exposées à de l'iodure de propidium pour une analyse par cytométrie en flux. La détection de l'apoptose a été réalisée à l'aide de la coloration à l'annexine V-FITC avec un kit de dosage de l'annexine V (kit de détection de l'apoptose Annexine V-FITC ; BD Pharmingen, San Diego, Californie, États-Unis). En bref, les cellules PANC-1 (1 × 105 cellules) ont été cultivées avec du mogroside V pendant 24 à 96 h, suivies d'un marquage à l'annexine V-FITC et à l'iodure de propidium conformément aux instructions du fabricant. Le pourcentage de cellules en apoptose dans les cellules témoins et traitées au mogroside V a été analysé par cytométrie en flux. Dans les tests d'inhibition de l'apoptose, les cellules ont été incubées avec ou sans mogroside V pendant 48 h en présence ou en l'absence de l'inhibiteur de l'apoptose zVAD (20 μmol/l). Les résultats ont été évalués avec le logiciel CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Les cellules ont été traitées avec du mogroside V pendant 24 h et ont été lysées à 4 ° C dans un tampon de lyse (0, 05 M Tris-HCl, pH 7, 4, 1% Triton X-100, 0, 1 M NaCl, 1% de désoxycholate de sodium et 0, 1% SDS) contenant 1 mM de fluorure de phénylméthanesulfonyle et un inhibiteur de protéase. Le lysat de protéine insoluble a été éliminé par centrifugation. Environ 15 μg de protéines des lysats cellulaires ont été séparés par SDS-PAGE à 12% et ont ensuite été transférés sur une membrane de fluorure de polyvinylidène. Les anticorps primaires suivants ont été utilisés pour l'analyse Western blot : STAT3 (dilution 1:1000), phospho-(p)-STAT3, CDKN1A, CDKN1B (p27), BCL2 et β-actine (tous de Sigma-Aldrich). Après incubation avec les anticorps secondaires appropriés (tous de Sigma-Aldrich), les membranes ont été développées avec ECL plus (ECL, Amersham Biosciences, GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA). Les mesures densitométriques des bandes de protéines ont été effectuées à l'aide du densitomètre d'imagerie GS-800 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Les caractéristiques in vivo des tumeurs pancréatiques ont été étudiées dans un modèle de xénogreffe de souris nude BALB/c. Des souris nues mâles BALB/c âgées d'environ 8 semaines de Vital River (Charles River Ltd. Co., Pékin, Chine) ont été maintenues dans un environnement exempt d'agents pathogènes. Pour établir un modèle tumoral de xénogreffe, des cellules PANC-1 (1 × 107) ont été injectées par voie sous-cutanée dans le flanc des souris. Les souris ont été réparties au hasard dans les cinq groupes suivants : (i) groupe témoin non traité, (ii) groupe NC (solution saline normale), (iii) groupe 2 mg/kg pc de mogroside V, (iv) groupe 10 mg/kg pc de mogroside V et (v) 30 mg/kg pc de mogroside V. Le mogroside V a été dissous dans une solution saline normale et a été administré aux souris dans un volume de 0,1 ml. Les tumeurs ont été mesurées avec un pied à coulisse tous les 3 jours. Les volumes tumoraux ont été déterminés en mesurant la longueur (l) et la largeur (w) des tumeurs, et en calculant le volume tumoral (V=w2l/2).32 Après 5 semaines, les souris ont été sacrifiées et les tumeurs ont été disséquées et pesées. Le taux d'inhibition de la croissance tumorale a été calculé à l'aide de la formule suivante : taux d'inhibition de la croissance tumorale (%) = (1−MT/MC) × 100, où MT et MC sont les masses tumorales moyennes des groupes de traitement et de contrôle, respectivement. L'utilisation des animaux était conforme aux directives sur le bien-être des animaux de l'Université d'agriculture de Pékin.

Après dissection, les tissus tumoraux ont été fixés immédiatement dans du formol tamponné au phosphate à 10 % et ont été inclus dans de la paraffine. La prolifération des cellules cancéreuses du pancréas a été estimée par coloration IHC avec un PCNA monoclonal de souris ou un anticorps Ki-67 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, Californie, États-Unis), et le nombre de cellules positives pour PCNA et Ki-67 dans une population de 200 cellules échantillonnées à un grossissement × 400 a été comptée. L'indice de marquage de l'antigène nucléaire des cellules proliférantes et l'indice de marquage Ki-67 ont ensuite été calculés. Après traitement avec le mogroside V, la vascularisation a été évaluée dans des coupes de tissus immunocolorés au CD31 et au VEGF. Le MVD a été calculé selon la méthode de Weidner.33, 34 L'immunohistochimie TUNEL a été réalisée à l'aide d'un kit de détection de la mort cellulaire in situ (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne) conformément aux instructions du fabricant.

Les niveaux d'expression des transcrits d'ARNm d'intérêt ont été déterminés par des tests RT-PCR.35 L'ARN total a été isolé à partir de tissus tumoraux frais avec le réactif TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). L'ARN amorcé par oligo (dT) (2 μg) a été transcrit avec la transcriptase inverse SuperScript II (Promega, Madison, WI, USA) conformément aux instructions du fabricant. L'ADNc obtenu a été utilisé pour déterminer la quantité d'ARNm de PCNA et de Ki-67 par PCR avec l'ADN polymérase Taq (Fermentas, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). GAPDH a été utilisé comme contrôle interne. Les séquences d'amorces suivantes ont été utilisées pour l'amplification de PCNA, Ki-67 et GAPDH : PCNA avant 5′-CCTGCTGGGATATTAGCTCCA-3′ et inverse 5′-CAGCGGTAGGTGTCGAAGC-3′ (Tm = 60 ° C, 109 pb); Ki-67 avant 5′-GCCTGCTCGACCCTACAGA-3′ et inverse 5′-GCTTGTCAACTGCGGTTGC-3′ (Tm = 60 ° C, 127 pb); GAPDH 5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′ et inverse 5′-AAGTGGTCCGTTGAGGGCAATG-3′ (Tm = 60 ° C, 101 pb). Les échantillons de PCR résultants ont été analysés par électrophorèse sur gel (agarose à 1,5 %). Les bandes d'ADN ont été examinées à l'aide d'un système de documentation sur gel (modèle Gel Doc 2000 ; Bio-Rad, Hercules, CA, États-Unis).

Les données ont été présentées comme la moyenne ± écart-type de trois expériences indépendantes pour l'étude in vitro et n = 6 pour l'étude in vivo. La signification statistique a été déterminée à l'aide du test t de Student. La survie a été estimée par la méthode de Kaplan-Meier et les valeurs obtenues ont été comparées par le test du log-rank. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide de GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) avec P <0,05 considéré comme statistiquement significatif

Cet article a été retiré. Veuillez consulter l'avis de rétractation pour plus de détails : https://doi.org/10.1038/s41389-023-00461-7

Un erratum à cet article a été publié : https://doi.org/10.1038/oncsis.2017.19

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Nous tenons à souligner le soutien de la Fondation de l'Université d'agriculture de Pékin (No.2017516005; No.1086716276).

C Liu et LH Dai : Ces auteurs ont contribué à parts égales à ce travail.

Key Laboratory of Urban Agriculture (North) of Ministry of Agriculture, Beijing University of Agriculture, Beijing, Chine

C Liu, DQ Dou & LQ Ma

Laboratoire national d'ingénierie pour les enzymes industrielles, Institut de biotechnologie industrielle de Tianjin, Académie chinoise des sciences, Tianjin, Chine

C Liu, LH Dai et YX Sun

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Correspondance à DQ Dou ou LQ Ma.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

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Cet article a été retiré. Veuillez consulter l'avis de rétractation pour plus de détails : https://doi.org/10.1038/s41389-023-00461-7

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Liu, C., Dai, LH., Dou, DQ. et coll. ARTICLE RETRACTE : Un édulcorant alimentaire naturel aux propriétés anticancéreuses pancréatiques. Oncogenèse 5, e217 (2016). https://doi.org/10.1038/oncsis.2016.28

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Reçu : 30 octobre 2015

Révisé : 12 février 2016

Accepté : 07 mars 2016

Publié: 11 avril 2016

Date d'émission : avril 2016

DOI : https://doi.org/10.1038/oncsis.2016.28

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